HYDS0067-50T-100T 七色多重免疫熒光試劑盒(六標(biāo)七色)
產(chǎn)品名稱:HYDS0067-50T-100T 七色多重免疫熒光試劑盒(六標(biāo)七色)
產(chǎn)品型號(hào):HYDS0067-50T-100T
產(chǎn)品廠商:上海古朵生物科技有限公司
簡單介紹
HYDS0067-50T-100T 七色多重免疫熒光試劑盒(六標(biāo)七色)的詳細(xì)介紹
產(chǎn)品名稱:七色多重免疫熒光試劑盒(六標(biāo)七色)
TSA 詳細(xì)原理是利用酪胺 Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在 HRP 催化 H202 下形成共價(jià)鍵結(jié)
合位點(diǎn)), 產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物, 該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、 組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié) 合, 這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積, 結(jié)果使其檢測信號(hào)得到 10-100 倍增強(qiáng)。 簡單 來說, 用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的 HRP (而不是直接偶聯(lián)熒光素) , 來催化后續(xù) 添加入體系的非活性熒光素。 熒光素在 HRP 和過氧化氫的作用下被活化, 跟臨近蛋白的酪氨酸殘基 共價(jià)偶聯(lián), 使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。 然后微波或煮沸或者水浴等熱修復(fù)處理,前一輪非共價(jià) 結(jié)合的抗體被洗掉, 共價(jià)結(jié)合的熒光素穩(wěn)定共價(jià)結(jié)合在樣本切片蛋白上。 再換個(gè)一抗來第二輪孵育 , 周而復(fù)始。 等到所有抗體孵育結(jié)束, 熒光素都結(jié)合好后, 最后去檢測結(jié)果。 由于每次體系中都只有單 一抗體孵育, 因此無需擔(dān)心抗體交叉反應(yīng), 以及一抗二抗種屬匹配問題, 大大減少了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)不同 種屬抗體選擇匹配的限制。 也就是說, 如果用 TSA 技術(shù), 同一張片子上所有的靶標(biāo)都可以選用特異性 高的兔單克隆抗體。 搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 而且信號(hào)放大的倍數(shù)大大增強(qiáng)。 本公司開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種: 480, 520, 570 , 620, 690, 780。 此試劑盒中的熒光染料可單獨(dú)或配合使用。 可以實(shí)現(xiàn)單標(biāo)、 雙標(biāo)、 三標(biāo)以及更多重?zé)晒夥糯?多重同源抗體熒光標(biāo)記等功能, 極大豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。
產(chǎn)品名稱:七色多重免疫熒光試劑盒(六標(biāo)七色)
試劑盒組成: 480 熒光染料 (即用型, 5mL),-20℃; 520 熒光染料(綠光)(即用型, 5mL),- 20℃; 570 熒光染料 (紅光) (即用型, 5mL), -20℃; 620 熒光染料 (即用型, 5mL), - 20℃; 690 熒光染料 (即用型, 5mL), -20℃; 780 熒光染料 (即用型, 5mL), -20℃; TSA+增強(qiáng)劑, 100ul, -20℃ (可選) ;
高敏多聚 hrp 山羊抗兔二抗 (20mL) 4℃。
備注: 480 熒光染料 、520 熒光染料 、570 熒光染料、 620 熒 光染料、 690 熒光染料、 780 熒光染料 在-20 度下, 均為固體, 使用之前需解凍。
產(chǎn)品名稱:七色多重免疫熒光試劑盒(六標(biāo)七色)
操作流程:
1、 石蠟切片脫蠟至水: 依次將切片放入二甲苯 Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇 Ⅰ5min-無水乙醇 Ⅱ。 取出放在通風(fēng)廚內(nèi),酒精晾干后放入自來水中稍洗, 蒸餾水洗。
2、 抗原修復(fù): 組織切片置于盛滿 PH 9.0 EDTA 堿性抗原修復(fù)液或者 PH6.0 檸檬酸修復(fù)緩沖液的修復(fù) 盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù) (也可以用高壓 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min等其他 熱修復(fù)方法) 。 中火 8min, ?;?nbsp;8min, 轉(zhuǎn)中低火 7min, 此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā), 切勿 干片。 自然冷卻后將玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次, 每次 5min。 (修復(fù)液 和修復(fù)條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來確定) 。
3 、 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶: 切片放入 3%過氧化氫溶液, 室溫避光孵育 15 min, 將玻片置于 PBS (PH7.4) 中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次, 每次 5min。
4、 BSA 封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈 (防止抗體流走) , 在圈內(nèi)滴加用 3%BSA-PBS (或者其他封閉液) 均勻覆蓋組織, 室溫封閉 30min。
5、 加一抗: 輕輕甩掉封閉液, 在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗 X,切片平放于避光濕盒 內(nèi) 4°C 孵育過夜或者 37 度 1-2h。 (濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))
6、 加 hrp 二抗: 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次,每次 5min。 切片稍甩干后 在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的hrp二抗覆蓋組織, 避光室溫孵育 50min, PBS 洗三次。
7、 熒光染料反應(yīng): XXX 熒光染料反應(yīng) 10-15min, PBS 洗三次。
8、 重復(fù) 2-7 步驟 (換用另外一種 XXX 熒光染料)
9、 DAPI 復(fù)染細(xì)胞核: 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次, 每次 5min。 切片稍 甩干后在圈內(nèi)滴加 DAPI 染液, 避光室溫孵育 10min。
10、 封片: 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3 次, 每次 5min。 切片稍甩干后用抗 熒光淬滅封片劑封片。
11、 鏡檢拍照: 切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖 像。
染料 | 激發(fā)波長 | 發(fā)射波長 |
DAPI 藍(lán)色 | 350 | 420 |
480 | 450 | 480 |
520 綠色 | 490 | 520 |
570 紅色 | 550 | 570 |
620 | 590 | 620 |
690 | 630 | 690 |
780 | 750 | 780 |
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