古朵小課堂：ELISA試劑盒為什么重復(fù)性差?

  主要有兩方面：

  一是實(shí)用性，看看你這方法是否實(shí)用，是否能夠推廣，如果你只想在自己的實(shí)驗(yàn)室用一用，也可不必考慮這一方面;

  二是可靠性，評(píng)價(jià)可靠性的主要指標(biāo)有檢測(cè)限、線性范圍、回收率、重復(fù)性與重現(xiàn)性等等?？煽啃允潜仨氃u(píng)價(jià)的。

  ELISA試劑盒重復(fù)性與重現(xiàn)性的區(qū)別與聯(lián)系?

  重復(fù)性(repeatability)與重現(xiàn)性(再現(xiàn)性，reproducibility)，二者都是用來(lái)評(píng)價(jià)分析結(jié)果的度。大多數(shù)人都不作嚴(yán)格區(qū)分，有的文獻(xiàn)中還常常混用。但是二者的實(shí)際意義是不一樣的。

  重復(fù)性：是指同一分析人員在同一條件下所得分析結(jié)果的度，

  重現(xiàn)性：是指不同分析人員或不同實(shí)驗(yàn)室在各自的條件下所得分析結(jié)果的度。也就是說(shuō)，重現(xiàn)性比重復(fù)性提出了高的要求。重復(fù)性好，重現(xiàn)性未必好。而重現(xiàn)性好，重復(fù)性肯定好。二者都是用多次分析結(jié)果的RSD來(lái)表示。

  對(duì)現(xiàn)代儀器分析而言，重復(fù)性是容易實(shí)現(xiàn)的，而重現(xiàn)性是重要的，也是方法驗(yàn)證必須考察的。

  方法的重現(xiàn)性包括連續(xù)多次進(jìn)樣分析的重復(fù)性、不同天數(shù)間的重復(fù)性、不同型號(hào)儀器間的重現(xiàn)性和不同實(shí)驗(yàn)室間的重現(xiàn)性。

  可能存在的原因有：

  1. 試劑盒儲(chǔ)存不當(dāng)或儲(chǔ)存環(huán)境差。您應(yīng)按照數(shù)據(jù)表上的建議儲(chǔ)存所有組分，而不是在室溫下過(guò)長(zhǎng)時(shí)間。

  2. 標(biāo)準(zhǔn)的制備不正確。您應(yīng)根據(jù)試劑盒的方案，使用推薦的稀釋劑嚴(yán)格重構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)。在使用前的10分鐘內(nèi)準(zhǔn)備好試劑，并迅速加入孔中。

  3. 添加樣本后混勻不充分。當(dāng)同時(shí)添加多個(gè)試劑時(shí)，您應(yīng)在渦旋混合器中充分混合試劑。在持有試劑時(shí)要小心，避免濺出。

  4. 孔讀數(shù)重復(fù)性差。您應(yīng)校準(zhǔn)酶標(biāo)儀。

  5. 孵育時(shí)間、洗滌條件、顯色條件和操作者不一致。您應(yīng)重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)。確保反應(yīng)條件和操作者一致。

  6. 洗滌不當(dāng)。您應(yīng)使用移液管加入200μL的洗滌緩沖液，或者用移液管充分填滿每個(gè)孔，但不允許溢出。檢查酶標(biāo)板洗滌器的所有孔口，確保充分的洗滌。

  7. 溫度不均勻。您應(yīng)在孵育期間保持恒定溫度，避免溫度波動(dòng)。

  8. 加樣本時(shí)壁面殘留過(guò)多或移液管尖劃傷孔底。您應(yīng)緩慢、小心地將移液管尖沿孔壁降低，避免觸碰孔底。

  9. 重復(fù)使用材料。您應(yīng)在樣本之間換移液管尖，在試劑之間換儲(chǔ)液器。

  10. 偶爾在截?cái)嘀蹈浇霈F(xiàn)的陽(yáng)性和陰性值。您應(yīng)對(duì)同一樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)測(cè)量，并在2個(gè)樣本中獲得相同的結(jié)果。

  11. 加樣本時(shí)的交叉污染。您應(yīng)在添加樣本時(shí)避免交叉污染。

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