ELISA實驗注意事項以及常見問題解答

  酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)被稱為免疫測定金標準。是一種免疫學測定方法。ELISA是用于測定抗原抗體，根據樣本不同的類型和檢測方法來進行相應的制定。主要類型有雙抗體夾心法、間接法、競爭法、雙抗原夾心法。

  雙抗體夾心法是常用的ELISA檢測類型，它是利用一個抗體進行捕獲，另外一個抗體進行檢測。雙抗體夾心法具有高特異性和高靈敏度，非常適用于復雜樣本，但夾心法通常檢測時間較長，難度大于其他方法。

  一、雙抗夾心法實驗步驟：

  二、雙抗夾心法實驗操作注意事項：

  1、樣品稀釋：

  (1)稀釋血清避免假陽性的發(fā)生(把蛋白按照一定的倍數稀釋，如10倍、20倍，將抗原進行稀釋包被反應;用稀釋好的陽性參閱血清和陰性參閱血清進行孵育后洗刷，加入酶結合物進行反應，孵育洗滌，加入底物顯色，停止反應后分別測定O.D值，O.D值≥1.0的抗原稀釋度為適合的包被濃度。陰性參閱血清O.D值<0.1-0.2。這樣陽性參閱血清和陰性參閱血清的O.D值就會有明顯差別)。

  (2)粉末型樣本需要短暫離心，如沾到管蓋、管壁需要將標準品沉入管底;加入蒸餾水時需短暫輕柔渦旋，靜置10-30min，充分溶解。

  (3)加水后等待充分溶解后可選擇吸吹或渦旋混勻。

  2、試劑平衡：

  (1)所有的試劑和樣本需平衡至室溫5-10min，避免產生動力學反應差異這會影響準確性。

  3、混勻：

  (1)稀釋前、后的樣品需進行搖床充分混勻。

  4、加樣操作：

  (1)定期校準移液搶。

  (2)加樣前需混勻，避免加入到孔壁上，盡可能避免氣泡產生。

  (3)避免樣本濺出(可用吸水紙吸取濺出液體)。

  (4)避免加樣槍頭反復吸取導致樣本污染。

  (5)加樣操作按照說明書的順序來進行，確保顯色時間一致。

  5、孵育：

  (1)震蕩孵育，加快抗原抗體之間的相互接觸，使反應加充分。

  (2)水浴溫度保持37℃。

  (3)水浴需要封閉防止污染。

  6、洗板：

  (1)洗液盡量不要溢出孔外。

  (2)拍過酶標記物后及時換吸水紙，避免影響實驗的準確性。

  (3)手工洗板時拍板要垂直且用力不能過猛，可避免交叉污染。

  (4)扣干后的酶標板應快速加液，避免干板太久。

  (5)采用全自動時需檢查各項水瓶是否充足。

  (6)采用全自動時檢查是否堵塞。

  7、顯色：

  (1)顯色需控制好時間(根據說明書操作),時間過短,結果偏低;時間過長,空白增高/非特異性顯色增加。

  (2)顯色呈梯度。

  8、比色：

  (1)跟換濾光片時注意錯用的可能性。

  9、檢測：

  (1)酶標儀使用前預熱10-15min，結果穩(wěn)定。

  (2)雙波長測定吸光值，可以減少指紋、雜質等帶來的誤差(檢測波長450nm-參考波長630nm(570nm))。

  二、試劑盒選擇注意事項：

  1、選擇明確：

  (1)樣本種屬類型

  (2)樣本類型：

  2、樣品中檢測物水平選擇：

  (1)寬動力學檢測范圍：對樣品種待測物水平沒有任何參考數據。

  (2)高靈敏度試劑：待檢物含量很低。

  3、樣品獲得性選擇：

  (1)通常試劑盒的樣品用量在40μL或100μL，少部分用量20μL左右。

  4、試劑盒技術參數選擇：

  (1)回收率達到80-120%之間。

  (2)按照標準示值誤差：100μg。

  (3)誤差系數<5%-8%。

  (4)建議優(yōu)先考慮雙單抗。

  (5)操作方便

  三、常見問題解答：

  1、樣本的處理、收集和保存問題：

  (1)細胞培養(yǎng)上清通過離心收集，分裝保存，溫度-20℃。

  (2)血清樣本分離管分離血清，樣本凝集30min后離心，吸取血清立即檢測，分裝保存，溫度-20℃。

  (3)血漿樣本采用EDTA收集樣本，需在30min內離心，吸取樣本立即檢測，分裝保存，溫度-20℃。

  (4)避免選擇嚴重溶血或高血脂樣本，收集后快速檢測并儲存，若未能在24h內檢測，可暫時存放2-8℃。

  (5)分析前樣本需緩慢恢復至室溫，注意是否有沉淀物需祛除干凈。

  2、樣本反復凍融，具有哪些影響：

  (1)蛋白易降解。

  (2)細胞上清凍融1-2次后，蛋白降解嚴重。

  3、陰性對照和空白對照的區(qū)別：

  (1)空白對照：稀釋液代替樣本，檢測顯色本地，讀取陽性、陰性、樣本孔的吸光值。

  (2)陰性對照：樣本與待檢測物具有同源、同質性，但不含有待檢測物質，可鑒別處理因素之間的差異性。

  4、添加顯色后，無色或陽性對照弱：

  (1)試劑盒需采用同批次。

  (2)注意稀釋倍數是否正確。

  (3)酶結合物是否未添加。

  (4)試劑是否添加錯誤。

  (5)顯色液是否變質。

  (6)確認各項容器干凈無污染。

  (7)注意配置時看清標簽和說明書。

  (8)觀察液面高度是否一致，避免試劑漏加。

  5、樣本濃度不正確：

  (1)標曲是否適合，有無失效等。

  (2)樣本含量或靈敏度較低無法被檢測到，濃縮樣本。

  (3)樣本含量或靈敏度較高，超過標曲濃度需稀釋樣本。

  6、為什么吸光值過高：

  (1)若如值正確，則顯色過高。

  (2)波長選擇錯誤，可選擇雙波長檢測。

  7、為什么吸光值低：

  (1)樣本未充分溶解，(混勻后需靜置30min)。

  (2)樣本反復凍融，活性減弱。

  (3)孵育的溫度和時間為滿足要求(按照說明書操作)。

  8、無梯度：

  (1)樣本污染，需要跟換樣本。

  (2)稀釋倍數錯誤，重新做。

  (3)抗體濃度高，換抗體或稀釋。

  (4)底物孵育是否時間和溫度過短。

  (5)孵育需封蓋。

  實驗結果匯總事項：

  ELISA試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發(fā)高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。古朵試劑盒

  標簽：ELISA 試劑盒 古朵生物 酶聯(lián)免疫試劑盒 抗體 抗原 標準品 稀釋液