古朵分享：瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)方法及原理

  實(shí)驗(yàn)方法原理

  瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳的主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。

  瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大，對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。

  蛋白質(zhì)和核酸會(huì)根據(jù)pH不同帶有不同電荷，在電場(chǎng)中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據(jù)這個(gè)原理可將其分開。電泳緩沖液的pH在6~9之間，離子強(qiáng)度0.02~0.05適合。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100 bp的DNA/片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20 kb，利用脈沖電泳，可分離高達(dá)107 bp的DNA/片段。

  DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。

  實(shí)驗(yàn)材料 DNA

  試劑、試劑盒 瓊脂糖TBE電泳緩沖液電泳載樣緩沖液溴化乙錠(EB)溶液母液DNAGreen

  儀器、耗材 水平式電泳裝置電泳儀臺(tái)式高速離心機(jī)恒溫水浴鍋微量移液槍微波爐或電爐紫外透射儀照相支架照相機(jī)及其附件

  實(shí)驗(yàn)步驟

  一、試劑配制

  1. 5×TBE緩沖液：450 mmol/L Tris-硼酸，10 mmol/L EDTA，pH值8.0。使用時(shí)將上述儲(chǔ)存液稀釋10倍至0.5×TBE緩沖液，可同時(shí)作為電泳及制膠用的緩沖液。

  二、制膠

  1. 根椐制膠量及凝膠濃度，在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中，加入準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉(總液體量不宜超過錐瓶的50%

  容量)。瓊脂糖粉末與0.5×TBE buffer的比例(w：v)參考表1，常用瓊脂糖濃度為0.7-1%。

  瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的分辨范圍

  2. 在錐瓶的瓶口上蓋上保鮮膜或牛皮紙，并在膜或紙上扎些小孔，然后在微波爐中加熱溶解瓊脂糖。加熱時(shí)，當(dāng)溶液沸騰后，請(qǐng)戴上防熱手套，小心搖動(dòng)錐瓶，使瓊脂糖充分均勻溶解。此操作重復(fù)數(shù)次，直至瓊脂糖*溶解。

  3. 使溶液冷卻至50℃-60℃左右，如需要可在此時(shí)加入溴化乙錠溶液(終濃度0.5 μg/ml)或按照1 μL / 30 mL的比例加入DNAgreen染料，并充分混勻。

  4. 將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當(dāng)位置處插上梳子。凝膠厚度一般在3~5 mm之間。制膠模如下圖所示，小膠倒入25-30 mL左右瓊脂糖溶液，大膠則60-70 mL左右，若需切膠回收，凝膠可適當(dāng)加厚。

  5. 在室溫下使膠凝固，大約30分鐘~1小時(shí)。

  三、上樣

  1. 取適量樣品與6×上樣緩沖液混勻(如：1 μl樣品與5 μl 6×上樣緩沖液)，用微量移液槍小心加入樣品槽中。

  2. 上樣量根據(jù)樣品濃度可適當(dāng)調(diào)整，若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量(一般小孔40 μl 為上限，大孔200 μl 為上限，具體和制膠膜規(guī)格相關(guān))。

  3. 每加完一個(gè)樣品要換槍頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。

  四、電泳

  1. 加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?10 V，電流在40 mA以上。

  2. 當(dāng)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2 cm時(shí)(約40 min)，停止電泳。

  3. 紫外下拍照并觀察。

  注意事項(xiàng)

  1. 5×TBE緩沖液放置時(shí)間過久會(huì)沉淀，因此一次性不要配太多。工作用電泳緩沖液為0.5×TBE緩沖液，取5×TBE緩沖液貯存液稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。

  2. 用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須統(tǒng)一。

  3. 瓊脂糖粉在微波爐中加熱時(shí)間不宜過長(zhǎng)，每次當(dāng)溶液起泡沸騰時(shí)停止加熱，否則會(huì)引起溶液過熱暴沸，造成瓊脂糖凝膠濃度不準(zhǔn)，也會(huì)損壞微波爐。溶解瓊脂糖時(shí)，必須保證瓊脂糖充分*溶解，否則，會(huì)造成電泳圖像模糊不清。

  4. 凝膠不立即使用時(shí)，請(qǐng)用保鮮膜將凝膠包好后在4℃下保存，一般可保存2～5天。

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